METODO DE STOLL

TECNICA DE CUENTA DE HUEVOS EN HECES LA TÉCNICA DE STOLL

FUNDAMENTO:

Después de identificar un párasito, puede ser necesario determinar la intensidad de lo infestación. Por lo general, la sintomatología de las enfermedades parasitarias se correlaciona con el número de parásitos presentes. Se le conoce la eliminación diaria de los huevecillos de varias especies de helmintos. Por lo tanto, se le hace una estimación del número del número de parásitos al contar el número de huevos en una cantidad conocida de heces y al calcular el número de gusanos que se requieren para producir dicho número. Sobre los resultados tienen influencia muchas variables, como dieta, mala digestión, los ciclos de reproducción del huevo y la consistencia de las heces. Pero las cuentas que se realizan después servirán antes y durante el tratamiento, pretenden guiarlo y las realizadas después servirán como referencia para el éxito del mismo. Los mejores resultados se logran cuando las cuentas se realizan en muestras sucesivas obtenidas en un periodo de varios días, de manera que se pueda determinar el procedió diario de liberación de huevos.

                MATERIAL                                                                             SUSTANCIAS

·         PROBETA GRADUADA DE 150ML                                   HIDROXIDO DE SODIO 0.1N

·         APLICADOR DE MADERA                                                 SI ES NECESARIO NAOH

·         CUENTAS DE VIDRIO

·         PORTAOBJETOS

·         MICROSCOPIO

PROCEDIMIENTO

·         Se llena una probeta graduada de 15.0 ml con 5.6 de hidróxido de sodio 0.1 N.

·         Con el palillo aplicador se agrega las heces hasta elevar el nivel del liquido a 6.0 ml.

·         Se le añade 5 cuentas de vidrio, se tapa con firmeza y se agita hasta que las heces se desmoronen por completo. Puede ser necesario que las heces duras se dejen reposar con NaOH durante varias horas o durante la noche, se agita el tubo un minuto y de inmediato se toman 0.075 ml de la suspensión y se colocan en un portaobjetos. Se coloca cubreobjetos de 22mm.

·         Con el aumento de 40x se cuenta los huevecillos de toda la preparación.

·         Se efectúa dos cuentas utilizando partes separadas de alicotas de 0.075 ml de la suspensión.

CALCULOS

1.       La disolución fecal original es de 1 en 15(4ml/60ml).Como se contaron los huevpos en el volumen total de 0.15ml. el número total de estos en 1ml de heces se encuentran al multiplicar la cuenta total por 100(1/5x0.1/15x100=1).

2.       Suponiendo que el procedimiento de una persona rebasa los 100g de heces por día, es posible calcular el número de huevos por día multiplicando el resultado por 100(o la cuenta de la suspensión original por 10000).

3.       Para determinar el número de parásitos hembras presentas, se divide el número diario de huevecillos que hay en las heces entre el número promedio de:

Hembra de la especie Necátor: 7000 huevos/día

Hembra de la especie Áscaris: 200000 huevos/dia

Hembra de la especie Trichuris: 7500 huevos/día

1.       Se encuentra la cantidad total de parásitos al multiplicar por dos resultados encontrados en el paso tres, ya que supone que en cualquier infestación hay un parásito macho por cada hembra.

2.       Algunas técnicos creen que se debe utilizar los factores de correlación de la consistencia de las heces para obtener resultados más exactos. Para esto, se debe multiplicar el ´número que se obtiene resultados más exactos. Para esto, se debe multiplicar el número que se obtiene en el paso uno por el factor apropiado. Heces formadas= 1_blandas, formadas=1.5_blandas diarreicas=3_ fluidas diarreicas=_muy liquidos=5.

 CONCLUSION

Utilidad
Recomendado especialmente para la investigación de geohelmintos.
Por su sencillez se puede utilizar en el campo, donde no se cuentan con demasiados materiales o reactivos para realizar otros métodos.
Los Huevos de helmintos de peso específico menor que la solución saturada de NaCl tienden a subir y adherirse a una lámina colocada en contacto con la superficie del líquido.
Este método es de alta sensibilidad en el diagnóstico de huevos livianos de helmintos: A. duodenale, N. americanus, A. lumbricoides, H. nana.
Limitaciones
  * No indicado en la búsqueda de huevos pesados ni de larvas.

  * Como no se filtra la materia fecal, las preparaciones pueden quedar muy sucias

tecnica de willis

METODO DE CONCENTRACION POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE

Fundamento:

La concentración de huevos, larvas y quistes en heces ha llegado a ser un procedimiento de rutina como parte de un examen completo para la detección de los parásitos intestinales y se puede realizar como complemento del examen directo.
Los procedimientos de concentración permiten la detección de protozoos y/o helmintos empleándose dos métodos: de sedimentación y flotación, o una combinación de ambos, para separar los protozoos y los huevos de helmintos de las heces, utilizando las diferencias en el peso específico.
Se deben emplear cuando la cantidad de muestra fuera pequeña, en un control de tratamiento o cuando se deba transportar poca cantidad de muestra a un lugar distante.

Concentración por Sedimentación

Los parásitos se concentran por acción de la gravedad, suspendiendo las heces en agua corriente, agua destilada o solución salina y dejando que sedimenten naturalmente o por centrifugación. Estos métodos son principalmente útiles para la concentración de quistes, o quistes y huevos.

Ventajas: es fácil de realizar, no requiere observación microscópica inmediata y se puede aplicar a la concentración de la mayoría de los parásitos intestinales.

Desventajas: la observación microscópica puede dificultarse por concentración de elementos
No parasitarios.

Existen varios métodos de sedimentación:

a) Sedimentación espontánea: método de sedimentación sencilla método de sedimentación simple de Lumbreras método de Baermann- Moraes
b) Sedimentación por centrifugación: método de Charles- Batherlemy método de formol-éter o Ritchie método de Acetato de Etilo (macro y micro técnica)

Se basa en la concentración mediante la centrifugación, con ayuda de formol y éter para separar y visualizar los elementos parasitarios.

Unas ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de material fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

Material Y EQUIPO:

Centrifuga                                         

Tubos de Ensaye cónicos de 15 ml.                                                     Soluc. Salina isotónica

Gasa cortada en cuadros                                                                       Soluc. De formaldehido al 100%

Embudos de polietileno                                                                          éter          

Vasos de precipitado de 50ml

Aplicadores de madera

Pipetas Pasteur con bulbo

Portaobjetos de 26x76mm

Cubreobjetos de 22x22mm

Microscopio

METODO

1. Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente1gr. De la materia fecal en el vaso de precipitado, se añade 10ml de solución salina y se homogeniza.  Nuestra muestra biológica tenía un olor fétido, de color café claro, no tenía ninguna anomalía, parecía de una persona sana.

2.      Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtro en el tubo cónico. Se puede poner  los tubos de las dos muestras iguales para después

3.      Se centrifuga la suspensión durante 2 minutos a 2000 rpm. Se decanta al sobrenadante y resuspende el sedimento con solución salina centrifugando, decantando y resuspendiendo 2 veces más. Para esto nosotros debemos tener mucho cuidado con la tapa del tubo cónico, porque puede botaren la centrifuga y se extiende todo en contenido.

4.      Al último sedimento se le agrega 10ml de solución de formaldehidos al 10% se mezcla y se deja reposar durante 10min.

5.      Se añade después 5ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos.

6.      Se centrifuga durante 2 minutos a 2000rmp.

7.      Después de centrifugarse observan 4 capas:

                 a) Éter en la superficial

                 b) Un tapón de restos fecales

                c) Formaldehido

8.       Sedimentos en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.   Parece un arcoíris muy bonito.                  

9.      Se decanta el sobrenadante

10.  Se induce la pipeta Pasteur hasta el sedimento, se extrae con cuidado una gota de sedimento y se coloca en un portaobjetos.

11.  Se le añade una gota de Lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubriéndolo con el mismo.

12.  Se observa la preparación en el mismo microscopio con objetivo de 10x y 40x.

OBSERVACIONES

Se observo en esta muestra con el objetivo  general no se encontraron nada interesante.

Frotis núm. uno

OBJETIVO  10%

Se observaron  pedazos DE COMIDA PERO NADA DE IMPORTANCIA, ALGUNAS GRASAS, CRISTALES DE ACIDO, ALGUNAS FIBRAS MUSCULARES.

OBJETIVO40%

Pues solo se logro confirmar que eran grasas.

Frotis numero 2

OBJETIVO General

La muestra  casi no tenia cosas interesantes, igual que la otra, se debe a que el paciente tiene una buena higiene y casi no come en la calle.

OBJETIVO SECO DEVIL

La muestra tenía una serie de cristales de ácidos grasos, algunas células de almidón, parecida a una entamoeba coli pero con la diferencia en la pared celular.

OBJETIVO SECO FUERTE

Se comprobó que no eran de almidón por que tenían muchas aglutinaciones en el centro, como masas.

CONCLUSIÓN

Se concluyo que esta práctica tuvo el fin de aprender y observar material fecal microscópico y dar a conocer que es lo que había en las heces de los pacientes enfermo  que viene a unos estudios de parasitos,para que lo puedan tratar si esta enfermo o si está bien poder descartar esta posibilidad.

Esta práctica se vasa en  la propiedad de la densidad de los huevecillos de los protozoos en la muestra, recolectada y destruida.

Se funciona con la técnica de faust para matar y colorearlos e identificarlos, es como el completo de esta técnica para poder dar resultados más exactos con esta técnica.

Mwtodo d flotación

METODO DE FLOTACION DE FAUST

Fundamentos:

Este método se utiliza solución de Zn, cuya densidad especifica es de 1.180 (33%), que conforma un medio de densidad más alta que los huevos Necátor 1.055, tricocéfalo 1.150, Áscaris febril más alta que los huevos livianos de estos helmintos con menor peso especifico que la solución , se concentren y broten. La concentración adecuada aconsejada es la que se usa como reactivo una solución acuosa de sulfato de Zn al 33% con una densidad de 1.180. El agua utilizada diluye y lava la materia fecal. El filtro con gasa doblada y evita que los detritos gruesos  trapacen las paredes, la centrifugación, enriquece en delgada película la superficie del liquido centrifugado con los huevos livianos de algunos hemintos.

Material:

• Porta Objetos                                                                        Sol. Acuosa de Sulfato de Zn
• Cubreobjetos
• Gasas
• Tubos de ensayo

Técnica:

1.      Mezclar bien una porción de materia fecal para preparar una superficie en 10 partes de agua destilada.

2.      Filtrar la suspensión a través de una gasa doblada en cuatro partes: sobre un tubo de centrifuga, ayudándose con el embudo pequeño.

3.      centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 min.

4.      Decantar el liquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento.

5.      Repetir el procedimiento 2 veces hasta que el liquido sobrenadante esté listo.

6.      Repetir el procedimiento 2 veces hasta que el liquido se sobrenadante reemplazándolo por igual cantidad de solución de sulfato de Zn al 33%. Mezclar bien la solución con el sedimento. Centrifugar durante 1 minuto a 1500 rpm.

7.      Tomar 3-4 gotas de las partículas que flotan en la superficie del líquido. Colocar en un porta objetos y mezclarla con 1-2 gotas de lugol, colocar cubre-objetos.

8.      Examinar al microscopio y reporte sus resultados.

Observaciones

PRIMERA TINCIÓN

A simple vista se logaban ver puntos blancos, pequeños que eran blancos separados un poco uno de cada uno. Con enfoque general se logro ver masas pequeñas un poco pequeñas.

Con Objetivo 10x se logro enfocar una de esas masas, se logro ver otras más pequeñas, pero en esas más pequeñas se identifico una un poco extraña.

Con Objetivo 40x se logro enfocar a esa masa, y se descubrió que esta era un quiste, por la     estructura que tenia, pues era un poco circular, con algo alrededor, como pelillos en otro circulo en donde se encontraba un como núcleo a simple vista pero se llego a la conclusión que era una huevecillo de Taenia solium o de Taenia saginata pero si me equivoco pues puede corregirme profesor y dígame en que me equivoque.

SEGUNDA TINCIÓN

En esta última tinción se encontraron cosas casi sin sentido, porque al mirarse al microscopio, pues se logro confundir algunas partículas de grasas con algunos trofozoitos pero como se sabe estos tienen unos centros un poco más negros.

Y porque no pueden ser quistes.

Conclusión

Es una técnica muy útil, fácil de hacer y tiene el índice efectivo de  80% a un 100% de todos los casos. Su principal objetivo es el de hacer flotar a los quistes y huevos gracias a la propiedad de la densidad de ciertas sustancias químicas. Es más ocupado que el de sedimentación para la concentración de quistes de protozoarios, y abundantes huevos en infecciones ligeras, pero la sedimentación es más útil para huevos de esquistosoma y operculados.

La flotación  con sulfato de cinc se usa más frecuente  y es preferible a la de azúcar, cloruro de calcio o salmuera. El tiempo óptimo para el examen de las muestras de la solución química es de cinco minutos, ya que los huevecillos tienden a desintegrase después de 30, por eso esta prueba debe de realizarse casi inmediatamente.

Cuando se realice esta práctica tenemos que tener medidas de seguridad en este caos los guantes, bata, y cubre para que estos parásitos no se transfieran a nuestro organismo.

Lo siguiente es que cada muestra se maneje como de alto riego, cuando se mezcle con agua, y al doblar la gasa, teniendo en cuenta que se dobla en cuatro partes, y se le coloca al embudo, para poder filtrar pedazos grandes, de estas mismas, para después, pasarla en el tubo de ensayo y centrifugarla, muchas veces, para deshacerse de pequeñas partículas, y para que hasta el último se vea lo que nos interesa con el sulfato de zinc, que tiene una densidad muy baja y esto ayuda a que los huevecillos suban hacia arriba, pescando con el asa de platino y quemando algunas veces para no tener partículas de la otra gota. Se espera unos minutos y es fácil de ver. Este es un método muy útil para alguna prueba de parásitos si el paciente presenta signos o síntomas anormales como la de evacuar con sangre, moco o ambas, o de dolor intenso en el hipocondrio derecho, o el de fiebre, y disentería, para descartar, si con parásitos o si es alguna otra cosa.